桂花树:从桂花树及其次生代谢产物样品中分离鉴
在本文中，有20 HNWSW真菌从桂花树的样品通过分离板的方法，由曲霉属鉴定分离。过其形态学和分子生物学，其次级代谢产物已经通过各种色谱技术分离出来。化，光谱数据和物理性质和化学性质的基础上，化合物结构被确定为如下：2，3- dihydrosorbicilline（1），sorbicillin（2），2，3-二氢-2-（1-丙烯）-6，8-二甲基-7-羟基色酮（3），邻苯二甲酸二丁酯（4），7-羟基异苯并呋喃-1（3H）酮（5）甲基二十烷酸（6）;化合物的α葡萄糖苷酶的乙酰胆碱酯酶抑制活性的抑制活性分别用埃尔曼量热法和PNPG方法，测定，结果表明，化合物1，2和4的上方具有抑制乙酰胆碱酯酶活性，而化合物1，3和5具有α-葡萄糖苷酶抑制活性。此，化合物1-2是从曲霉属中分离的第一次，并已报道具有乙酰胆碱酯酶和α葡萄糖苷酶的抑制活性。键词桂花树木;蘑菇;隔离和识别;次级代谢产物;生物活性码数CLC R284.1文档标识代码AAbstract从木制中国琼脂的20-HNWSW真菌通过在板的分离方法分离并通过曲霉形态学和分子生物学的代谢物识别侧被分离并通过各种色谱技术纯化和鉴定的化合物的结构如下：2，3-dihydrosorbicilline（1），sorbicillin（2）（2R）-2，3-二氢-7- -hydroxyl- 6，8-二甲基-2 - [（E） - 丙-1-烯基]苯并吡喃-4-酮（3），邻苯二甲酸二丁酯（4），7-羟基-1-（3H）异苯并呋喃酮（5） ，二十烷酸（6）基于光谱证据和物理化学性质。乙酰胆碱酯酶和α葡萄糖苷酶的化合物的抑制活性分别用埃尔曼比色试验和PNPG方法，来确定。合物1，3和5显示出α葡萄糖苷酶抑制活性，而化合物1-2首先从曲霉属中分离中，第一报告他们的乙酰胆碱酯酶和s的抑制活性α-葡萄糖苷酶。国桂花树木;蘑菇;隔离和识别;次级代谢产物;生物活性DOI 10.3969 / j.issn.1000-2561.2018.08.022土桂花树（LOUR。白木香]，也被称为香料名，万向，壁炉香，桂花树等的女儿它是属瑞香科桂花树在中国的热带和亚热带地区的常绿乔木和中国桂花树的唯一植物来源的植物，主要分布在海南，广东，福建和其他地方[1 ]。
健康白木不会产生桂花树，但经过自然因素（雷电，火灾，昆虫等）或人为因素（切割，钻孔，接种等），损坏或刺激，经过长时间的反应，逐渐改变桂花树的形式。“医生”陶弘景包括：“从桂花树，熏鲁巷，舌，鸡，麝香，糖湛，枫香和微小的。这是最老的药盘。香木是温暖的，有苦，苦味，脾，胃，肾经，用于胸部和腹部，腹痛，呃逆，肾功能衰竭的肿胀，气体和哮喘等[2]。桂花树木燃烧时，会散发出强烈的香味。在许多国家都是一种有价值的香料，经常被改造成手工艺品和其他手工艺品。经报道于文献[3]，所述桂花树形成与champignons.Il在桂花树真菌的分离和鉴定目前许多研究。统的方法的识别蘑菇经常确定描述morphologiques.Cette方法是简单和直接的基础上的种类，但有太多的不确定因素，很容易与分类和菌株的鉴定[干扰4]。
着科学技术的进步，分子生物学也得到了迅速发展，核酸序列分析已成为鉴定真菌的重要手段。录内部间隔区（ITS）序列分析是最常见的鉴定方法之一。ITS是位于真菌核糖体DNA，它主要包含三个内转录间隔段1（ITS1），5.8S rRNA和两个内转录间隔区的18S和28S的基因（之间的基因区片段ITS2）;它的长度一般为650.~750 bp [5]。ITS区域不包括成熟核糖体。此，该片段具有高适应性，可以接受更多突变，更快速地进化并且是多态的。5.8S rRNA基因是高度保守的，并且具有异源广泛的同源性，ITS1和ITS2适度保守区和保守的种类几乎是相同的和相差很大来自一个物种到另一个。ITS序列分析可以用作真菌鉴定[6-8]的一个重要指标，具有形态特征，等等相关联的，以使更科学的和可信的菌株的识别。前，从桂花树的样本导出真菌的次级代谢产物进行了研究与发酵液和活性化合物的分离和鉴定的抗菌活性仍然很少。初，该研究小组研究了秦安桂花树木样品中的真菌，并分离鉴定了镰刀菌属的次生代谢产物。过各种色谱和光谱方法，获得了一系列生物活性。合物[9]。了深入研究从桂花树源不同的真菌和分析次级代谢产物的生物活性，通过Shimuxiang并确定所产生的研究中分离真菌桂花树HNWSW-曲霉菌通过形态学和分子生物学。）。外，6种化合物，从所提取的发酵产物从乙酸乙酯PDB菌株中分离和筛选的乙酰胆碱酯酶和s的抑制活性化合物“α葡糖苷酶。料与方法材料和试剂桂花树样品平定县，化州市，广东省被购买，并通过中国研究院的王俊博士热带生物技术研究所鉴定热带农业科学是广东白木乡生产的桂花树木。要试剂：默克买硅胶C18反相和Sephadex LH-20，和乙酰胆碱酯酶，碘化物thioacétylcholine中，dithiodinitrobenzoïque酸（DTNB）和他克林。萄糖苷酶购自Solarbio，Acarbose购自北京百灵威科技有限公司。质琼脂培养基马铃薯（PDA）：马铃薯200克，葡萄糖20g，琼脂18克，自来水至1000ml基于马铃薯葡萄糖马铃薯200的液体介质g，葡萄糖20克，自来水容量为1000毫升。器和设备Autospec300质谱仪和AV-500核磁共振谱仪，德国布鲁克; AUTOPOL III旋光仪，鲁道夫，德国，水循环装置CA-1111的冷却和旋转蒸发SB-1100，EYELA日本公司;高压灭火HV-110 Bacteria，Hirayama，日本; Multiskan FC微孔板读板机，Thermo Scientific，USA; XY-JH-21BC净化车间，上海昊仪器有限公司; 1260 Analytical HPLC，Agilent，United States; BP221S，千分之一电子秤，北京赛多利斯平衡有限公司;光学显微镜CX31，日本公司OLYMPUS。法分离和应变HNWSW-20的鉴定：取琼脂块以水冲洗，以75％的酒精中浸泡2分钟，取出它，把它在溶液中0.1％汞，5分钟，取出，用无菌水冲洗3~5次。最后一次冲洗液施加到干净的PDA板上作为检查以验证消毒是否完成。理桂花树的片切成小片0.5厘米×0.5厘米，放置在PDA平板（含0.01％氯霉素）和培养在培养箱中在28℃下在平板上培养菌落，分离菌株并通过平板蚀刻和菌丝顶部纯化进行纯化。态学鉴定：纯化HNWSW-20的菌划线PDA培养基上，然后将灭菌的条带插入到以45度角的培养基中并在28℃放置在培养箱中4天，待处理细菌。
长丝被开发和粘附到玻璃盖片，将载片轻轻地除去和置于显微镜下观察菌丝和孢子的形态。子生物学鉴定：DNA提取，PCR扩增，真菌通用引物（ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG和ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC），通过扩增和传输获得生物工程（上海）有限公司的PCR产物的纯化用于测序，测序将结果提交至NCBI基因库以进行同源性比对。活在PDA板上的HNWSW-20菌菌株的发酵HNWSW-20后，除去1 1mm×1mm的质量，并放置在500ml烧瓶（含有150毫升PDB），以通过以150rpm摇动培养物3天获得发芽溶液。5毫升萌发溶液接种到1000毫升（含400毫升PDB培养基）的烧瓶中并在室温下培养50天设定，120瓶发酵。取，分离和次级代谢物HNWSW-20菌株的发酵液中的每一个瓶中加入1的纯化：1至乙酸乙酯，混合，并且将菌丝体细胞和孢子，通过均化器的Bruker破坏通过三层纱布过滤FA25并除去滤液。
混合物用EtOAc萃取三次并蒸发。乙酸乙酯萃取液在减压下在硅胶柱上进行色谱分离，并用石油醚洗脱 - 氯仿，氯仿 - 甲醇作为流动相，得到13分数（从1号到13号）。分4（126.0毫克）用Sephadex LH-20（流动相：甲醇）的柱色谱法分离，得到两个级分Fr.4-1和Fr.4-2。Fr.4-1（110.5毫克），然后进行凝胶层析柱的Sephadex LH-20（流动相为氯仿 - 甲醇中，体积比为1：1），然后通过HPLC分离半制备（流动相为甲醇 - 水）。积比为70:30，得到化合物4（8.1mg）。数4-2（12.0毫克）通过半制备性HPLC（流动相甲醇 - 水70:30）分离，得到化合物1（4.2毫克）。用甲醇 - 水作为流动相（Fr.5-1至Fr.5-9），用C18柱色谱梯度洗脱Brother5（1.0g）。获得Fr.5-2-1和Fr.5-2：Fr.2-2（9.2毫克）中的溶液用Sephadex凝胶色谱LH-20（氯仿 - 甲醇的流动相，体积比1）分离 - 2两个流。5-2-2分数（5.2毫克）通过半制备性HPLC（流动相在甲醇 - 水，25:75）分离，得到化合物5（1.2毫克）。过半制备HPLC（流动相甲醇 - 水60:40）分离级分5-4，得到化合物3（5.2mg）。得到化合物2（4.0毫克）：级分5-6，通过柱色谱法用Sephadex LH-20凝胶（1流动相氯仿 - 甲醇，1）分离。石油醚 - 氯仿梯度洗脱级分5-9作为流动相，并通过硅胶柱色谱法纯化，得到化合物6（43.5mg）。试抑制乙酰胆碱酯酶活性的生物活性测试对乙酰胆碱酯酶的化合物的抑制活性通过Ellman等人的方法来确定。[10]，DMSO是溶剂，他克林是阳性对照，阴性对照DMSO。算公式如下：抑制率=（A0 - A1）/ A0，其中a0代表阴性对照和A1的平均吸光度，平均测试样品的吸光度。α-葡糖苷酶的抑制活性的测试：根据由钟Anurakkun等[描述的PNPG方法（4-硝基苯基α-d-D-吡喃葡萄糖苷）的化合物的α葡萄糖苷酶抑制活性的评价11]。卡波糖溶液用作阳性对照，DMSO-PBS（10％）溶液用作阴性对照。算公式如下：抑制率= [（B1 - B0） - （A1 - A0）] /（B1 - B0）×100％其中A0表示背景对照组的吸光度A1表示实验组的吸光度，B0表示白色。照组的吸光度B1代表阴性对照组的吸光度。果和分析蘑菇识别HNWSW-20：针对PDA支撑的菌落呈圆形，在中心稍微凸起，白色起初，白绿色梯度之后和淡黄色上菌落的背面。生孢子梗细而顶部膨胀形成球形顶袋，而分生孢子呈球形，在顶袋生长在字符串的形式。株HNWSW-20的形态特征类似于文献[7]中对曲霉属菌种的描述。子生物学的识别号在NCBI序列所得的BLAST比对后，系统发生树，使用MEGA 6.06软件构成，如示于图2的结果表明，HNWSW-20菌株是最接近曲霉属和它的与烟曲霉DYJ1（1）（登录号KM268635）的菌株的同源性高达100％。有完整的形态学和分子生物学，菌株HNWSW-20已被鉴定为曲霉属菌株。合物化合物1的结构的鉴定：黄色粉末，ESI-MS做了[MH] - 峰值在m / z 233和分子式为C14H18O3结合的NMR光谱数据1 H-NMR（CD 3 OD，500 MHz的）.DELTA.h：7.44（1H，S，H-6），5.48（2H，M，H-4”，5 ），2.94（2H，T，J = 7.5赫兹，H2- 2 ），2.34（2H，米，H2-3），2.14（3H，S，H3-8），2.04（3H，S，H3-7），1.61（3H， m，H3-6）; 13 C NMR（CD 3 OD，125 MHz）的AC：206.0（C-1 ），162.5（C-2），162.0（C-4），131.0（C-4），130，图4（C-6），126.8（C-5“），117.2（C-5），113.4（C-3），111.9（C-1），38.7（C- 2），29.0（C-3），18.1（C-6），16.4（C-8），8.0（C-7）。面的数据是与化合物2的数据从根本上一致”，3-dihydrosorbicilline通过范过叨[12]报道，并确定化合物1是2 ，3-dihydrosorbicilline。合物2：黄色粉末，ESI-MS做了[MH] - 峰值在m / z 231，这被认为是C14H16O3与NMR光谱数据。1 H-NMR（CDCl 3，500 MHz）的.DELTA.h：13.58（1H，S，2-OH），7.46（1H，DD，J = 14.7，10.6赫兹，H-3“），7 ，44（1H，S，H-6），7.44（1H，S，H-6），6.94（1H，S，H-2“），6.31（2H，M，H-4 ”，5 ），2.22（3H，S，H3-8），2.14（3H，S，H3-7），1.91（3H，d，J = 6.4赫兹，H3-6 “）; 13 C NMR（CDCl 3，125 MHz）的OC：192.7（C-1 ），162.7（C-2），158.7（C-4），144.6（C-3），141， 3（C-5 ），131.0（C-4），128.9（C-6），122.0（C-2“），114.5（C-5），113.7（ C-3），110.5（C-1），19.1（C-6），15.8（C-8），7.7（C-7）。据上述数据的分析，结合文献[13]，化合物2被鉴定为sorbicillin。合物3：无色粉末，[α] D = -20.4（c 0.26，MeOH）; ESI-MS，得到峰[M +的Na] +在m / z 255，结合的NMR光谱数据，确定分子式为C14H16O3 1 H NMR（CDCl 3，500兆赫）H：7.56（IH，S ，H-2），5.87（1H，DQ，J = 15.4，6.5赫兹，H-5“），5.70（1H，DDD，J = 15.4，6.3赫兹， 1.5赫兹，H-4 ），4.85（1H，M，H-3），2.69（2H，M，H-2“），2.20（3H，S，H-7 ），2.13（3H，s，H-8），1.77（3H，d，J = 6.5Hz，H-6）; 13 C NMR（CDCl 3，125 MHz）的AC：191.9（C-1 ），159.6（C-6），158.9（C-4），129.9（C-5），129， 0（C-4“），125.9（C-2），117.3（C-3），114.6（C-1），110.7（C -5），78.3（C- 3），42.8（C-2），18.0（C-6），15.5（C-7），8.2（C-8）。面的数据是与该化合物基本上一致由英等人[14]提出了2个数据，并且可以确认，化合物3是2，3-二氢-2-（1-丙烯基）-6- ，8-二甲基-7-羟基色酮。合物4：无色油状物。
ESI-MS得到的峰[M + H] +在m / z 279，这被认为是C16H22O4结合的NMR光谱数据。1 H-NMR（CD 3 OD，500 MHz）的.DELTA.h：7.72（2H，DD，J = 5.7，3.3赫兹，H-3，6），7.61（2H，DD，J = 5.7 ，5.7赫兹，H-4，5），4.29（4H，T，J = 6.6赫兹，H-8，8“），1.72（4H，dt的，J = 6.6， 14.5赫兹，H-9，9 ），1.45（4H，M，H-10，10），0.98（6H，T，J = 7.4赫兹，H-11，11 ）; 13 C NMR（CD 3 OD，125 MHz）的OC：169.3（C-7，7“），133.6（C-1，2），132.3（C-4，5），129.9（C- 3，6），66.6（C-8，8 ），31.7（C-9，9），20.3（C-10，10“），14.0（C-11，11 “）。述数据基本上与Cao等人[15]提出的化合物5的数据一致，并且证实化合物4是邻苯二甲酸二丁酯。合物5：白色粉末，ESI-MS得到的峰[M +的Na] +在m / z 173和分子式C8H6O3被假定为与NMR谱数据结合使用。1 H-NMR（CDCl 3，500 MHz）的.DELTA.h：7.57（1H，T，J = 7.8赫兹，H-5），6.98（1H，d，J = 7.8赫兹，H-4） ，6.94（1H，d，J = 7.8Hz，H-6），5.33（2H，s，H 2 -3）; 13 C NMR（CDCl 3，125 MHz）的OC：172.7（C-1），156.6（C-7“），146.7（C-7），137.0（C-5），115.3 （C-4），113.4（C-6），110.9（C-3），70.7（C-3）。据上面给出的，与文献[16]的组合进行分析，桂花树化合物5被鉴定为7-羟基 - 异苯并呋喃-1（3H） - 酮。合物6：白色固体，得到峰[M +的Na] +在m / z 255，其被假设为C21H42O2与NMR光谱数据组合。1 H NMR（CDCl 3，500 MHz）的.DELTA.h：3.64（3H，S，H3 -21），2.28（2H，T，J = 7.6赫兹，H-2），1.59（2H，米，3H），1.29（32H，M，H-4至H-19），0.86（3H，T，J = 6.9赫兹，H-20）; 13 C NMR（CDCl 3，125 MHz）的OC：174.37（C-1），51.5（C-21），34.2（C-2），32.0（C-18），28.8至29.8（C-4至C-17），25.1（C-3），22.8（C-19），14.2（C-20）。上数据与朱少辉等[17]提出的二十碳酸甲酯数据基本一致。此确定化合物6是二十碳酸甲酯。
表所示，化合物1，2和4具有乙酰胆碱酯酶和化合物3的弱抑制活性没有检测乙酰胆碱酯酶的抑制活性。抑制活性α葡糖苷酶α葡糖苷化合物的抑制活性的结果1至5中示出在表2其中，化合物1〜3是第一个检测的抑制活性的α葡萄糖苷酶。表所示，化合物1和3对α葡萄糖苷酶很强的抑制活性和它们的活性比阳性对照，他克林的略高，和化合物5具有α-的弱抑制活性葡萄糖苷酶，化合物2. 4未检测到α-葡萄糖苷酶的抑制活性。论在该研究中，从琼脂中分离并纯化出HNWSW-20真菌，并鉴定为曲霉属（Aspergillus sp。行了研究BDP的发酵后的次级代谢产物，并从光谱数据的分析中所确定的总六种化合物：2，3- dihydrosorbicilline（1），sorbicillin（2），2，3-二氢2。- （1-丙烯）-6，8-二甲基-7-羟基色酮（3），邻苯二甲酸二丁酯（4），7-羟基异苯并呋喃-1（3H） - 酮（5），二十烷酸甲酯（6 ），其中1-2种化合物首次从曲霉中分离出来。合物1至3是第一个检测乙酰胆碱酯酶抑制活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物。α-葡糖苷酶可以限制或延迟糖的分解中α葡糖苷酶的digestif.Linhibiteur管是用于II型糖尿病的降血糖药中的一个，被广泛应用于临床实践中。18]在这项研究中，化合物1和3具有α-葡糖苷酶的强抑制活性，其活性比阳性对照他克林的略高，而化合物5具有A-的弱抑制活性葡萄糖苷酶可能是一种新的葡萄糖苷酶抑制剂，提供了一些思考的食物。外，化合物1，2和4具有低乙酰胆碱酯酶抑制活性。些研究人员认为，桂花树的形成是由于基础设备的微生物感染等一系列的病理症状的工厂经历了一个令人兴奋的和秘密的防御性反应逐渐树脂中形成的外观桂花树。Xiuhuan章及其同事[19]显示，在健康部内生真菌的优势种群和成形树脂Baimuxiang是不同的，即枝顶孢属。Penicillium sp。的阴华明[20]已经通过实验证明，桂花树形成类似于两级干主要致病菌如Lasiodiplodia theobromae示出，但是从桂花树的非形成的阶段分离。很大的不同。他的研究[21]表明，根毛霉栎proliferatum镰刀菌和木霉能促进harzii桂花树的形成。表明桂花树木和真菌之间存在某种相关性。香富含色酮化合物[22-24]。研究中分离的化合物1至5均具有苯环，化合物1至3是结构相似的化合物。合物3形成环和颜色。的基本结构。菌株的次级代谢产物与桂花树木中色酮衍生物的形成有关仍有待研究。考文献[1]哈福黛眉蒋雯丽，文化和人造香料技术桂花树实践[M]，北京：中国农业出版社，2015：28〜29。2]黎轰念，泉溪梅林Huanze等。化学成分的进步，桂花树的药理作用及临床应用[J.]中国药学，2011年，22（35）：3 349- 351 [3]丰Naixian - 真菌的初步研究桂花树内生菌[D]。昌大学，2008。4]章之骅康应天，海洋真菌[J]安徽农业科学，2009年，37（21）的分类和鉴定的分析方法：825-9 826 9 [ 5] JW下跌，酵母夫布拉特ģ先生分离株dendrorhousand红发夫酵母基于rDNA序列分析序列IGS和ITS [J]，中华工业微生物与生物技术，1999年，23（1）：677 681. [6]龚明波，范炳权，王宏远。
[8]孙端方，齐学勤和王家福：589至595 [9]肖文杰，汪培：内生真菌红豆杉与鉴定[J] .Acta微生物学报，2008年，48（5）的分离，李伟等，内生真菌Fusarium sp。次生代谢产物研究。HP-2 J]。国抗生素杂志，2016年，41（4）：241〜246 [10]埃尔曼GL，考特尼KD，安德烈V，和其他的新和快速比色测定乙酰胆碱酯酶活性的[J]。化药理学，1961，7（2）：88〜95。
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健康白木不会产生桂花树，但经过自然因素（雷电，火灾，昆虫等）或人为因素（切割，钻孔，接种等），损坏或刺激，经过长时间的反应，逐渐改变桂花树的形式。“医生”陶弘景包括：“从桂花树，熏鲁巷，舌，鸡，麝香，糖湛，枫香和微小的。这是最老的药盘。香木是温暖的，有苦，苦味，脾，胃，肾经，用于胸部和腹部，腹痛，呃逆，肾功能衰竭的肿胀，气体和哮喘等[2]。桂花树木燃烧时，会散发出强烈的香味。在许多国家都是一种有价值的香料，经常被改造成手工艺品和其他手工艺品。经报道于文献[3]，所述桂花树形成与champignons.Il在桂花树真菌的分离和鉴定目前许多研究。统的方法的识别蘑菇经常确定描述morphologiques.Cette方法是简单和直接的基础上的种类，但有太多的不确定因素，很容易与分类和菌株的鉴定[干扰4]。
着科学技术的进步，分子生物学也得到了迅速发展，核酸序列分析已成为鉴定真菌的重要手段。录内部间隔区（ITS）序列分析是最常见的鉴定方法之一。ITS是位于真菌核糖体DNA，它主要包含三个内转录间隔段1（ITS1），5.8S rRNA和两个内转录间隔区的18S和28S的基因（之间的基因区片段ITS2）;它的长度一般为650.~750 bp [5]。ITS区域不包括成熟核糖体。此，该片段具有高适应性，可以接受更多突变，更快速地进化并且是多态的。5.8S rRNA基因是高度保守的，并且具有异源广泛的同源性，ITS1和ITS2适度保守区和保守的种类几乎是相同的和相差很大来自一个物种到另一个。ITS序列分析可以用作真菌鉴定[6-8]的一个重要指标，具有形态特征，等等相关联的，以使更科学的和可信的菌株的识别。前，从桂花树的样本导出真菌的次级代谢产物进行了研究与发酵液和活性化合物的分离和鉴定的抗菌活性仍然很少。初，该研究小组研究了秦安桂花树木样品中的真菌，并分离鉴定了镰刀菌属的次生代谢产物。过各种色谱和光谱方法，获得了一系列生物活性。合物[9]。了深入研究从桂花树源不同的真菌和分析次级代谢产物的生物活性，通过Shimuxiang并确定所产生的研究中分离真菌桂花树HNWSW-曲霉菌通过形态学和分子生物学。）。外，6种化合物，从所提取的发酵产物从乙酸乙酯PDB菌株中分离和筛选的乙酰胆碱酯酶和s的抑制活性化合物“α葡糖苷酶。料与方法材料和试剂桂花树样品平定县，化州市，广东省被购买，并通过中国研究院的王俊博士热带生物技术研究所鉴定热带农业科学是广东白木乡生产的桂花树木。要试剂：默克买硅胶C18反相和Sephadex LH-20，和乙酰胆碱酯酶，碘化物thioacétylcholine中，dithiodinitrobenzoïque酸（DTNB）和他克林。萄糖苷酶购自Solarbio，Acarbose购自北京百灵威科技有限公司。质琼脂培养基马铃薯（PDA）：马铃薯200克，葡萄糖20g，琼脂18克，自来水至1000ml基于马铃薯葡萄糖马铃薯200的液体介质g，葡萄糖20克，自来水容量为1000毫升。器和设备Autospec300质谱仪和AV-500核磁共振谱仪，德国布鲁克; AUTOPOL III旋光仪，鲁道夫，德国，水循环装置CA-1111的冷却和旋转蒸发SB-1100，EYELA日本公司;高压灭火HV-110 Bacteria，Hirayama，日本; Multiskan FC微孔板读板机，Thermo Scientific，USA; XY-JH-21BC净化车间，上海昊仪器有限公司; 1260 Analytical HPLC，Agilent，United States; BP221S，千分之一电子秤，北京赛多利斯平衡有限公司;光学显微镜CX31，日本公司OLYMPUS。法分离和应变HNWSW-20的鉴定：取琼脂块以水冲洗，以75％的酒精中浸泡2分钟，取出它，把它在溶液中0.1％汞，5分钟，取出，用无菌水冲洗3~5次。最后一次冲洗液施加到干净的PDA板上作为检查以验证消毒是否完成。理桂花树的片切成小片0.5厘米×0.5厘米，放置在PDA平板（含0.01％氯霉素）和培养在培养箱中在28℃下在平板上培养菌落，分离菌株并通过平板蚀刻和菌丝顶部纯化进行纯化。态学鉴定：纯化HNWSW-20的菌划线PDA培养基上，然后将灭菌的条带插入到以45度角的培养基中并在28℃放置在培养箱中4天，待处理细菌。
长丝被开发和粘附到玻璃盖片，将载片轻轻地除去和置于显微镜下观察菌丝和孢子的形态。子生物学鉴定：DNA提取，PCR扩增，真菌通用引物（ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG和ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC），通过扩增和传输获得生物工程（上海）有限公司的PCR产物的纯化用于测序，测序将结果提交至NCBI基因库以进行同源性比对。活在PDA板上的HNWSW-20菌菌株的发酵HNWSW-20后，除去1 1mm×1mm的质量，并放置在500ml烧瓶（含有150毫升PDB），以通过以150rpm摇动培养物3天获得发芽溶液。5毫升萌发溶液接种到1000毫升（含400毫升PDB培养基）的烧瓶中并在室温下培养50天设定，120瓶发酵。取，分离和次级代谢物HNWSW-20菌株的发酵液中的每一个瓶中加入1的纯化：1至乙酸乙酯，混合，并且将菌丝体细胞和孢子，通过均化器的Bruker破坏通过三层纱布过滤FA25并除去滤液。
混合物用EtOAc萃取三次并蒸发。乙酸乙酯萃取液在减压下在硅胶柱上进行色谱分离，并用石油醚洗脱 - 氯仿，氯仿 - 甲醇作为流动相，得到13分数（从1号到13号）。分4（126.0毫克）用Sephadex LH-20（流动相：甲醇）的柱色谱法分离，得到两个级分Fr.4-1和Fr.4-2。Fr.4-1（110.5毫克），然后进行凝胶层析柱的Sephadex LH-20（流动相为氯仿 - 甲醇中，体积比为1：1），然后通过HPLC分离半制备（流动相为甲醇 - 水）。积比为70:30，得到化合物4（8.1mg）。数4-2（12.0毫克）通过半制备性HPLC（流动相甲醇 - 水70:30）分离，得到化合物1（4.2毫克）。用甲醇 - 水作为流动相（Fr.5-1至Fr.5-9），用C18柱色谱梯度洗脱Brother5（1.0g）。获得Fr.5-2-1和Fr.5-2：Fr.2-2（9.2毫克）中的溶液用Sephadex凝胶色谱LH-20（氯仿 - 甲醇的流动相，体积比1）分离 - 2两个流。5-2-2分数（5.2毫克）通过半制备性HPLC（流动相在甲醇 - 水，25:75）分离，得到化合物5（1.2毫克）。过半制备HPLC（流动相甲醇 - 水60:40）分离级分5-4，得到化合物3（5.2mg）。得到化合物2（4.0毫克）：级分5-6，通过柱色谱法用Sephadex LH-20凝胶（1流动相氯仿 - 甲醇，1）分离。石油醚 - 氯仿梯度洗脱级分5-9作为流动相，并通过硅胶柱色谱法纯化，得到化合物6（43.5mg）。试抑制乙酰胆碱酯酶活性的生物活性测试对乙酰胆碱酯酶的化合物的抑制活性通过Ellman等人的方法来确定。[10]，DMSO是溶剂，他克林是阳性对照，阴性对照DMSO。算公式如下：抑制率=（A0 - A1）/ A0，其中a0代表阴性对照和A1的平均吸光度，平均测试样品的吸光度。α-葡糖苷酶的抑制活性的测试：根据由钟Anurakkun等[描述的PNPG方法（4-硝基苯基α-d-D-吡喃葡萄糖苷）的化合物的α葡萄糖苷酶抑制活性的评价11]。卡波糖溶液用作阳性对照，DMSO-PBS（10％）溶液用作阴性对照。算公式如下：抑制率= [（B1 - B0） - （A1 - A0）] /（B1 - B0）×100％其中A0表示背景对照组的吸光度A1表示实验组的吸光度，B0表示白色。照组的吸光度B1代表阴性对照组的吸光度。果和分析蘑菇识别HNWSW-20：针对PDA支撑的菌落呈圆形，在中心稍微凸起，白色起初，白绿色梯度之后和淡黄色上菌落的背面。生孢子梗细而顶部膨胀形成球形顶袋，而分生孢子呈球形，在顶袋生长在字符串的形式。株HNWSW-20的形态特征类似于文献[7]中对曲霉属菌种的描述。子生物学的识别号在NCBI序列所得的BLAST比对后，系统发生树，使用MEGA 6.06软件构成，如示于图2的结果表明，HNWSW-20菌株是最接近曲霉属和它的与烟曲霉DYJ1（1）（登录号KM268635）的菌株的同源性高达100％。有完整的形态学和分子生物学，菌株HNWSW-20已被鉴定为曲霉属菌株。合物化合物1的结构的鉴定：黄色粉末，ESI-MS做了[MH] - 峰值在m / z 233和分子式为C14H18O3结合的NMR光谱数据1 H-NMR（CD 3 OD，500 MHz的）.DELTA.h：7.44（1H，S，H-6），5.48（2H，M，H-4”，5 ），2.94（2H，T，J = 7.5赫兹，H2- 2 ），2.34（2H，米，H2-3），2.14（3H，S，H3-8），2.04（3H，S，H3-7），1.61（3H， m，H3-6）; 13 C NMR（CD 3 OD，125 MHz）的AC：206.0（C-1 ），162.5（C-2），162.0（C-4），131.0（C-4），130，图4（C-6），126.8（C-5“），117.2（C-5），113.4（C-3），111.9（C-1），38.7（C- 2），29.0（C-3），18.1（C-6），16.4（C-8），8.0（C-7）。面的数据是与化合物2的数据从根本上一致”，3-dihydrosorbicilline通过范过叨[12]报道，并确定化合物1是2 ，3-dihydrosorbicilline。合物2：黄色粉末，ESI-MS做了[MH] - 峰值在m / z 231，这被认为是C14H16O3与NMR光谱数据。1 H-NMR（CDCl 3，500 MHz）的.DELTA.h：13.58（1H，S，2-OH），7.46（1H，DD，J = 14.7，10.6赫兹，H-3“），7 ，44（1H，S，H-6），7.44（1H，S，H-6），6.94（1H，S，H-2“），6.31（2H，M，H-4 ”，5 ），2.22（3H，S，H3-8），2.14（3H，S，H3-7），1.91（3H，d，J = 6.4赫兹，H3-6 “）; 13 C NMR（CDCl 3，125 MHz）的OC：192.7（C-1 ），162.7（C-2），158.7（C-4），144.6（C-3），141， 3（C-5 ），131.0（C-4），128.9（C-6），122.0（C-2“），114.5（C-5），113.7（ C-3），110.5（C-1），19.1（C-6），15.8（C-8），7.7（C-7）。据上述数据的分析，结合文献[13]，化合物2被鉴定为sorbicillin。合物3：无色粉末，[α] D = -20.4（c 0.26，MeOH）; ESI-MS，得到峰[M +的Na] +在m / z 255，结合的NMR光谱数据，确定分子式为C14H16O3 1 H NMR（CDCl 3，500兆赫）H：7.56（IH，S ，H-2），5.87（1H，DQ，J = 15.4，6.5赫兹，H-5“），5.70（1H，DDD，J = 15.4，6.3赫兹， 1.5赫兹，H-4 ），4.85（1H，M，H-3），2.69（2H，M，H-2“），2.20（3H，S，H-7 ），2.13（3H，s，H-8），1.77（3H，d，J = 6.5Hz，H-6）; 13 C NMR（CDCl 3，125 MHz）的AC：191.9（C-1 ），159.6（C-6），158.9（C-4），129.9（C-5），129， 0（C-4“），125.9（C-2），117.3（C-3），114.6（C-1），110.7（C -5），78.3（C- 3），42.8（C-2），18.0（C-6），15.5（C-7），8.2（C-8）。面的数据是与该化合物基本上一致由英等人[14]提出了2个数据，并且可以确认，化合物3是2，3-二氢-2-（1-丙烯基）-6- ，8-二甲基-7-羟基色酮。合物4：无色油状物。
ESI-MS得到的峰[M + H] +在m / z 279，这被认为是C16H22O4结合的NMR光谱数据。1 H-NMR（CD 3 OD，500 MHz）的.DELTA.h：7.72（2H，DD，J = 5.7，3.3赫兹，H-3，6），7.61（2H，DD，J = 5.7 ，5.7赫兹，H-4，5），4.29（4H，T，J = 6.6赫兹，H-8，8“），1.72（4H，dt的，J = 6.6， 14.5赫兹，H-9，9 ），1.45（4H，M，H-10，10），0.98（6H，T，J = 7.4赫兹，H-11，11 ）; 13 C NMR（CD 3 OD，125 MHz）的OC：169.3（C-7，7“），133.6（C-1，2），132.3（C-4，5），129.9（C- 3，6），66.6（C-8，8 ），31.7（C-9，9），20.3（C-10，10“），14.0（C-11，11 “）。述数据基本上与Cao等人[15]提出的化合物5的数据一致，并且证实化合物4是邻苯二甲酸二丁酯。合物5：白色粉末，ESI-MS得到的峰[M +的Na] +在m / z 173和分子式C8H6O3被假定为与NMR谱数据结合使用。1 H-NMR（CDCl 3，500 MHz）的.DELTA.h：7.57（1H，T，J = 7.8赫兹，H-5），6.98（1H，d，J = 7.8赫兹，H-4） ，6.94（1H，d，J = 7.8Hz，H-6），5.33（2H，s，H 2 -3）; 13 C NMR（CDCl 3，125 MHz）的OC：172.7（C-1），156.6（C-7“），146.7（C-7），137.0（C-5），115.3 （C-4），113.4（C-6），110.9（C-3），70.7（C-3）。据上面给出的，与文献[16]的组合进行分析，桂花树化合物5被鉴定为7-羟基 - 异苯并呋喃-1（3H） - 酮。合物6：白色固体，得到峰[M +的Na] +在m / z 255，其被假设为C21H42O2与NMR光谱数据组合。1 H NMR（CDCl 3，500 MHz）的.DELTA.h：3.64（3H，S，H3 -21），2.28（2H，T，J = 7.6赫兹，H-2），1.59（2H，米，3H），1.29（32H，M，H-4至H-19），0.86（3H，T，J = 6.9赫兹，H-20）; 13 C NMR（CDCl 3，125 MHz）的OC：174.37（C-1），51.5（C-21），34.2（C-2），32.0（C-18），28.8至29.8（C-4至C-17），25.1（C-3），22.8（C-19），14.2（C-20）。上数据与朱少辉等[17]提出的二十碳酸甲酯数据基本一致。此确定化合物6是二十碳酸甲酯。
表所示，化合物1，2和4具有乙酰胆碱酯酶和化合物3的弱抑制活性没有检测乙酰胆碱酯酶的抑制活性。抑制活性α葡糖苷酶α葡糖苷化合物的抑制活性的结果1至5中示出在表2其中，化合物1〜3是第一个检测的抑制活性的α葡萄糖苷酶。表所示，化合物1和3对α葡萄糖苷酶很强的抑制活性和它们的活性比阳性对照，他克林的略高，和化合物5具有α-的弱抑制活性葡萄糖苷酶，化合物2. 4未检测到α-葡萄糖苷酶的抑制活性。论在该研究中，从琼脂中分离并纯化出HNWSW-20真菌，并鉴定为曲霉属（Aspergillus sp。行了研究BDP的发酵后的次级代谢产物，并从光谱数据的分析中所确定的总六种化合物：2，3- dihydrosorbicilline（1），sorbicillin（2），2，3-二氢2。- （1-丙烯）-6，8-二甲基-7-羟基色酮（3），邻苯二甲酸二丁酯（4），7-羟基异苯并呋喃-1（3H） - 酮（5），二十烷酸甲酯（6 ），其中1-2种化合物首次从曲霉中分离出来。合物1至3是第一个检测乙酰胆碱酯酶抑制活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物。α-葡糖苷酶可以限制或延迟糖的分解中α葡糖苷酶的digestif.Linhibiteur管是用于II型糖尿病的降血糖药中的一个，被广泛应用于临床实践中。18]在这项研究中，化合物1和3具有α-葡糖苷酶的强抑制活性，其活性比阳性对照他克林的略高，而化合物5具有A-的弱抑制活性葡萄糖苷酶可能是一种新的葡萄糖苷酶抑制剂，提供了一些思考的食物。外，化合物1，2和4具有低乙酰胆碱酯酶抑制活性。些研究人员认为，桂花树的形成是由于基础设备的微生物感染等一系列的病理症状的工厂经历了一个令人兴奋的和秘密的防御性反应逐渐树脂中形成的外观桂花树。Xiuhuan章及其同事[19]显示，在健康部内生真菌的优势种群和成形树脂Baimuxiang是不同的，即枝顶孢属。Penicillium sp。的阴华明[20]已经通过实验证明，桂花树形成类似于两级干主要致病菌如Lasiodiplodia theobromae示出，但是从桂花树的非形成的阶段分离。很大的不同。他的研究[21]表明，根毛霉栎proliferatum镰刀菌和木霉能促进harzii桂花树的形成。表明桂花树木和真菌之间存在某种相关性。香富含色酮化合物[22-24]。研究中分离的化合物1至5均具有苯环，化合物1至3是结构相似的化合物。合物3形成环和颜色。的基本结构。菌株的次级代谢产物与桂花树木中色酮衍生物的形成有关仍有待研究。考文献[1]哈福黛眉蒋雯丽，文化和人造香料技术桂花树实践[M]，北京：中国农业出版社，2015：28〜29。2]黎轰念，泉溪梅林Huanze等。化学成分的进步，桂花树的药理作用及临床应用[J.]中国药学，2011年，22（35）：3 349- 351 [3]丰Naixian - 真菌的初步研究桂花树内生菌[D]。昌大学，2008。4]章之骅康应天，海洋真菌[J]安徽农业科学，2009年，37（21）的分类和鉴定的分析方法：825-9 826 9 [ 5] JW下跌，酵母夫布拉特ģ先生分离株dendrorhousand红发夫酵母基于rDNA序列分析序列IGS和ITS [J]，中华工业微生物与生物技术，1999年，23（1）：677 681. [6]龚明波，范炳权，王宏远。
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